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首頁(yè) 服務(wù)與支持 產(chǎn)品FAQ

限制性內(nèi)切酶常見問題解答

Q:不酶切或酶切不完全

A:

? 酶失活或濃度過低:用已知含目的酶切位點(diǎn)的對(duì)照 DNA 測(cè)試該酶活性;酶應(yīng)貯存于 -20℃,-70℃時(shí)會(huì)凍結(jié);避免反復(fù)凍融降低酶活;可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)加大酶

量。

? DNA 濃度不合適:推薦 50 μl 反應(yīng)體系酶切 1-2 μg DNA;DNA 過量時(shí)可適當(dāng)增加酶量。

? DNA 被抑制劑污染:與對(duì)照 DNA 樣品一起酶切,驗(yàn)證其是否被抑制;重新純化 DNA 樣品。

? DNA 可能形成超螺旋:不同酶對(duì)超螺旋結(jié)構(gòu) DNA 消化效率不一樣,可適當(dāng)加大酶量。

? 識(shí)別位點(diǎn)過于接近 DNA 末端:一般在識(shí)別位點(diǎn)兩端各加 6 個(gè)保護(hù)堿基可確保酶切效率。

? 識(shí)別位點(diǎn)不存在:驗(yàn)證 DNA 序列。

? 反應(yīng)條件非最優(yōu)化:緩沖液使用不當(dāng);按比例使用新鮮緩沖液重復(fù)實(shí)驗(yàn);按照推薦方案進(jìn)行雙酶切或分步酶切。

? 甲基化封閉酶切位點(diǎn):PCR 產(chǎn)物未甲基化;使用 dam-/dcm-菌株轉(zhuǎn)化。


Q:出現(xiàn)非預(yù)期帶型

A:

? 確定正確帶型:酶切產(chǎn)物與對(duì)照 DNA 樣品一起電泳,確定是未消化完的底物條帶或者是星號(hào)活性產(chǎn)生的非預(yù)期條帶。

? DNA 樣品污染:重新制備或純化樣品

? 含其它酶切位點(diǎn):驗(yàn)證 DNA 序列


Q:DNA 電泳呈彌散帶

A:

? 酶與 DNA 結(jié)合緊密未完全解離:使用隨酶提供的 DNA Loading Buffer 上樣電泳;或另加入終濃度為0.05-0.2% 的 SDS。

? 核酸酶污染:制備新的底物樣品;使用新的緩沖液和水。

? 電泳條件不合適:使用新鮮的電泳緩沖液和凝膠;合適的電流電壓避免過熱。


Q:星號(hào)活性 (特異性降低或改變)

A:

? 高甘油濃度 (>5% v/v):酶儲(chǔ)存液含 50% 甘油;因此酶量不超過反應(yīng)體積的10%。選擇 50 μl的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系,以減少反應(yīng)過程中水的蒸發(fā)而提高甘油濃度。

? 非最適緩沖液:盡可能使用推薦緩沖液,離子濃度和 pH 的改變會(huì)引起星號(hào)活性。

? 存在有機(jī)溶劑 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等):確保樣品在制備過程中不含任何有機(jī)物,如 DNA 制備過程中可能混入的乙醇。

? 混有其它二價(jià)離子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除樣品中二價(jià)離子

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