Q: 擴增效率低：條帶較弱或無擴增
A：
? 酶的原因：實驗表明，PCR酶對于DNA具有一定的偏好性。如使用一種酶經(jīng)過優(yōu)化難以獲得理想擴增時，可以嘗試其它PCR酶。
? 模板引物的原因：確保模板、引物的品質(zhì)，保證沒有降解。另外，如果模板含有較多的抑制物時（如植物基因組模板），推薦使用抗抑制能力強的PCR酶；還可以對模板進行梯度稀釋后擴增，摸索合適的模板用量。
? 反應(yīng)體系與條件的原因：增加循環(huán)數(shù)、降低退火溫濕度、適當(dāng)提高Mg2+工作濃度，都可以提高擴增效率，但同時會導(dǎo)致特異性與保真性下降，需要根據(jù)具體的實驗要求優(yōu)化合適的條件。
Q: 擴增特異性差：引物二聚體、雜帶、拖尾等
A:
? 選擇熱啟動酶：與普通PCR酶相比，熱啟動酶具有更高的擴增效率和特異性。
? 優(yōu)化反應(yīng)體系與條件：升高退火溫度可以有效提高特異性。另外減少循環(huán)數(shù)、適當(dāng)降低Mg2+工作濃度，也可以提高特異性，但都會導(dǎo)致擴增效率的下降，需要根據(jù)具體的實驗要求優(yōu)化合適的條件。還可以嘗試某些特殊的程序，如巢式PCR、Touch Down PCR等。
? PCR產(chǎn)物需要進行后續(xù)實驗時，如果確定有目的條帶擴增，可以凝膠回收目的條帶。
Q：擴增保真性差：突變、插入、缺失等
A：
? 選擇高保真酶：B型DNA聚合酶，如Pfu系列酶，具有3’-5’的外切酶活性，能夠校正錯配的堿基，具有高保真性。另外，復(fù)合酶中由于有B型DNA聚合酶的存在，也具有較高的保真性，但保真性比B型DNA聚合酶要低。
? 優(yōu)化PCR體系與條件：適當(dāng)增加模板量、減少循環(huán)數(shù)，可以降低突變機率，提高保真性。
確認(rèn)保真性低的原因：有時保真性低并非由PCR引起，PCR通常只會導(dǎo)致數(shù)量很少的單堿基突變。如果產(chǎn)物測序后，發(fā)現(xiàn)大量的突變，或有明顯的插入、缺失等，很可能是來自其它實驗步驟，如DNA在大腸桿菌中復(fù)制是發(fā)生重組，或是測序時的污染。這種情況，可以重新反轉(zhuǎn)錄或選保真性更高的反轉(zhuǎn)錄酶。
Q：Pfu酶擴增如何加“A”？
A：
? 在10 μl體系中，加入純化后PCR產(chǎn)物、0.2 μl Taq DNA Polymerase、0.5 μl 10 mM dNTP (或0.5 μl 2.5 mM dATP)、1 μl 10xTaq Buffer， 72℃ 反應(yīng)10-15分鐘即可。
Q：出現(xiàn)假陽性擴增
A：
? 引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。
? 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
