文章信息
文章題目：Structural basis for intrinsic transcription termination
期刊：Nature
發(fā)表時間：2023年1月11日
主要內(nèi)容：中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心合成生物學重點實驗室張余研究團隊和美國威斯康辛大學麥迪遜分校Robert Landick團隊以及浙江大學馮鈺團隊合作在Nature雜志上發(fā)表了文章Structural basis for intrinsic transcription termination，該研究捕獲了細菌固有轉(zhuǎn)錄終止的中間狀態(tài)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了細菌RNA聚合酶識別終止序列、停止轉(zhuǎn)錄并解離RNA的分子機制。
原文鏈接：http://www.nature.com/articles/s41586-022-05604-1
使用TransGen產(chǎn)品：
pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（CU201）
研究背景
轉(zhuǎn)錄是基因表達的第一步，是遺傳中心法則的重要組成。RNA聚合酶以DNA為模板進行的轉(zhuǎn)錄分為轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止三個階段。高效和準確的終止是所有生物基因轉(zhuǎn)錄所必需的，轉(zhuǎn)錄終止異常會引起RNA降解、干擾下游基因表達、干擾DNA復制、破壞基因組穩(wěn)定性等。RNA聚合酶一般通過兩種途徑終止轉(zhuǎn)錄，一條途徑是依賴于終止因子的轉(zhuǎn)錄終止，例如細菌RNA聚合酶依賴具有RNA解旋酶活性的Rho因子終止轉(zhuǎn)錄，動植物細胞Pol II依賴具有RNA外切酶活性的XRN終止mRNA轉(zhuǎn)錄。另一種是不依賴于終止因子的轉(zhuǎn)錄終止，也稱為固有轉(zhuǎn)錄終止。固有轉(zhuǎn)錄終止是噬菌體、細菌和真核生物RNA聚合酶（Pol III）保守的轉(zhuǎn)錄終止方式。
文章概述
在轉(zhuǎn)錄終止環(huán)節(jié)，RNA聚合酶需要從高速的延伸狀態(tài)（～50 堿基/秒）緊急剎車停止轉(zhuǎn)錄，隨后RNA聚合酶迅速發(fā)生構(gòu)象變化，RNA和DNA從高度穩(wěn)定的RNAP-DNA-RNA復合物解離。由于轉(zhuǎn)錄終止具有高度動態(tài)和反應迅速的特征，因此解析轉(zhuǎn)錄終止的結(jié)構(gòu)和分子機制具有較大難度。研究團隊借鑒前人的研究成果，拆分了轉(zhuǎn)錄終止序列，捕獲了三個關鍵的轉(zhuǎn)錄終止中間態(tài)結(jié)構(gòu)。首先解析了只包含U-tract序列的TTC-pause冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。其次，解析了包含U-tract序列和部分RNA發(fā)卡的TTC-hairpin結(jié)構(gòu)。最后，利用antisense RNA模擬形成完整的發(fā)卡結(jié)構(gòu)并誘導轉(zhuǎn)錄終止，解析了TTC-release的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。據(jù)此，研究團隊提出了固有轉(zhuǎn)錄終止的四個反應步驟：
1. 轉(zhuǎn)錄暫停（TTC-pause）：Poly U序列阻止RNAP結(jié)合NTP，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄暫停。
2. RNA發(fā)卡部分折疊（TTC-hairpin）：RNA發(fā)卡折疊進入RNA聚合酶的RNA退出通道，誘導RNA聚合酶構(gòu)象變化，削弱RNAP和RNA-DNA雜合雙鏈的相互作用。
3. 轉(zhuǎn)錄泡DNA閉合（TTC-rewinding）：轉(zhuǎn)錄泡的兩條DNA單鏈堿基重新配對，破壞RNA-DNA雜合雙鏈。
4. RNA釋放（TTC-release）：RNA聚合酶釋放RNA，但仍可以在基因組上自由滑動，最終解離或者滑動至啟動子DNA開始下一輪轉(zhuǎn)錄。
圖1：細菌固有轉(zhuǎn)錄終止機制模型
該研究報導了細菌固有轉(zhuǎn)錄終止關鍵中間態(tài)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，還原了細菌固有轉(zhuǎn)錄終止的全過程，揭示了細菌RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄終止序列暫停轉(zhuǎn)錄以及RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)在RNAP內(nèi)部折疊并誘導RNA釋放的分子機制?；卮鹆思毦鶵NA聚合酶如何識別轉(zhuǎn)錄終止序列、暫停轉(zhuǎn)錄、釋放RNA的分子機制。該研究拓展了人們對于轉(zhuǎn)錄終止的認識，提出的“DNA-rewinding triggered RNA release”的機制為真核RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止機制提供了參考。
全式金產(chǎn)品支撐
優(yōu)質(zhì)的試劑是科學研究的利器。全式金的無縫克隆試劑盒pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（CU201）助力本研究。
pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（CU201）
本產(chǎn)品利用特殊的重組酶和同源重組的原理，可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有15-25 bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組，可以實現(xiàn)1-5個片段的高效無縫拼接。多次榮登Nature、Science、Nature Biotechnology等知名期刊，助力科學研究。
? 產(chǎn)品特點：
? 快速：僅需要15分鐘反應時間。
? 簡單：不受片段酶切位點的影響，無需對片段酶切。
? 高效：陽性率達95%以上。
? 無縫：不引入額外的序列。
? 實驗結(jié)果
? 不同長度單片段連接
將不同長度PCR片段（50 bp、2 kb、5 kb、8 kb）分別插入PG載體后，分別用內(nèi)切酶酶切鑒定插入效果。結(jié)果顯示，不同長度的PCR片段均正確插入PG載體。
? 不同長度多片段連接
將不同長度PCR片段(600 bp，900 bp，1200 bp，1500 bp，1800 bp，片段兩端設計Nde I酶切位點)，混合后插入pUC19載體后，使用Nde I內(nèi)切酶酶切鑒定插入效果。結(jié)果顯示，不同長度的PCR片段均正確插入pUC19載體。
全式金產(chǎn)品再一次登上Nature期刊，證明了大家對全式金產(chǎn)品品質(zhì)和實力的認可，也完美詮釋了全式金一直以來秉承的“品質(zhì)高于一切，精品服務客戶”的理念。全式金始終在助力科研的道路上砥礪前行，希望未來能與更多的科研工作者并肩奮斗，用更多更好的產(chǎn)品持續(xù)助力科研。
使用pEASY?-Basic Seamless Cloningand Assembly Kit（CU201）產(chǎn)品發(fā)表的部分文章：
? You L L, Omollo E O, Yu C Z, et al. Structural basis for intrinsic transcription termination [J]. Nature, 2023.
? Liu R, Yang J, Yao J, et al. Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins[J]. Nature Biotechnology, 2022.
? Chen Q, Hu T, Li X, et al. Phosphorylation of SWEET sucrose transporters regulates plant root: shoot ratio under drought[J]. Nature plants, 2022.
? Wu M, Xu G, Han C, et al. lncRNA SLERT controls phase separation of FC/DFCs to facilitate Pol I transcription[J]. Science, 2021.
? Dou W, Zhu Q, Zhang M, et al. Screening and evaluation of the strong endogenous promoters in Pichia pastoris[J]. Microbial cell factories, 2021.
